Os polimorfismos de genes LRP1 estão associados ao risco prematuro de doença cardiovascular em pacientes com hipercolesterolemia familiar | Revista Española de Cardiología

Introdução

Hipercolesterolemia familiar (FH) é caracterizada por altos níveis de colesterol de lipoproteína de baixa densidade no plasma. Leva a depósitos elevados do colesterol no tecido, aterosclerose acelerada, e aumento do risco de doença cardiovascular prematura (PCVD) .1 A anomalia genética mais comum consiste em mutações no gene do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR); A frequência populacional de hipercolesterolemia familiar heterozigenta (HFH) é de aproximadamente 1/500. Embora geneticamente a doença seja causada por mutações no gene LDLR, o fenótipo clínico da FH pode variar independentemente da mutação e esta variabilidade é assumida a ser devida a fatores ambientais e genéticos.2, 3

Descoberta Variações em outros genes que podem modificar a suscetibilidade a eventos cardiovasculares é de grande interesse por causa de seu possível uso como preditores de doença.4 Os genes envolvidos na captação de colesterol e homeostase são bons candidatos para este tipo de estudo. A proteína 1 de baixa densidade relacionada ao receptor de lipoproteína (LRP1) é um receptor de transmembrão multilicente pertencente à família LDLR que liga lipoproteínas de baixa densidade e facilita a remoção de uma ampla variedade de ligandos envolvidos em fibrinólise, atherogênese e trombogênese. 6, 7 a superexpressão da LRP1 na placa aterosclerótica foi demonstrada em modelos animais e humanos.8, 9 vários estudos mostraram uma relação entre as alterações na expressão LRP1 e doença coronariana.8, 10 a superexpressão também foi descrita na proteína e ARNm de pacientes com Homozygous FH.11 No geral, publicou resultados indicam que o LRP1 pode ser um receptor chave na patogênese da aterosclerose.

O objetivo deste estudo foi analisar se existem polimorfismos genéticos LRP1 que estão associados Com a ocorrência de PCVD em FH.

Métodos População

O estudo inicialmente incluiu 339 casos de pacientes com FH heterozigoso não relacionado a partir do estudo Safeheart12, 13 (” s “no material suplementar). Os pacientes receberam um diagnóstico de doença cardiovascular (CVD) se houvesse uma história de infarto do miocárdio, bypass coronariano ou angioplastia, angina peitoris com aterosclerose coronariana diagnosticada angiograficamente (estenose > 50%), acidente vascular cerebral, ou um evento vascular periférico. A doença cardiovascular foi considerada PCVD se o evento ocorreu antes de 55 anos de idade em homens e antes de 65 anos de idade em mulheres.14 Para cada paciente, foram coletados dados em níveis lipídicos no sangue, hipertensão, diabetes mellitus e fumar; Dados antropométricos também foram registrados. As características da população do estudo são mostradas na Tabela 1; Mutações LDLR foram identificadas em todos os pacientes. Detalhes das mutações encontradas e sua classificação com base na atividade LDLR residual (null, deficiente ou indeterminado) pode ser encontrada em “métodos” e tabela 1 no material suplementar.

Tabela 1. Características dos pacientes do estudo Com hipercolesterolemia familiar heterozigótica, agrupada por doença cardiovascular prematura


td não pcvd (n = 262) pcvd (n = 77) p
homens 111 (42.4) 47 (35.9) .004
mulheres 151 (57.6) 30 (41.1)
idade, anos 45,2 ± 15,3 53.19 ± 11.3
IMC 26.3 ± 4,8 28,01 ± 5,0 .014
hipertensão 42 (16.1) 20 (26) .06
fumantes 115 (43.8) 42 (54.5) .067
Diabetes 11 (4) 3 (4) .98
Colesterol total, mg / dl 287,1 ± 62,1 281,1 ± 70.2 .512
LDL colesterol, mg / dl 215,3 ± 58,7 209 ± 67,7 .925
hdl colesterol, mg / dl 52,2 ± 13 51,3 ± 17,4 .24
triglicerídeos, mg / dl 92.5 (38-320) 94.5 (44-258) .589
apopa, mg / dl 141,1 ± 35.2 138,8 ± 32,1 .204
Apob, mg / dl 166.4 ± 43,9 159,4 ± 41 .256
efeito de a mutação na atividade LDLR .527
null alelo 161 (61.6) 51 (66.2)
baixa atividade 75 (28,5) 22 (28.6)
Undetermined Activity 26 (9.9) 4 (5.2)

APOA, apolipoprotein a; Apob, apolipoproteína B; IMC, índice de massa corporal; HDL, lipoproteína de alta densidade; LDL, lipoproteína de baixa densidade; LDLR, receptor de lipoproteína de baixa densidade; PCVD, doença cardiovascular prematura. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão, não. (%) ou medianas (intervalo).
significância estatística foi definida na p

genotipagem

primeiro procuramos polimorfismos no promotor LRP1 através de polimorfismos de conformação de cadeia única e sequenciamento em uma amostra de 86 pacientes com HFH. Em seguida, analisamos a Associação Genética de 10 polimorfismos com PCVD; O DNA foi extraído do sangue periférico usando o kit de purificação de DNA genômico Wizard® (Promega).

Rastreio de polimorfismos no promotor LRP1

Veja “Métodos” e Tabela 2 no material suplementar.

Associação genotípica Estudo

Selecionamos 10 polimorfismos de nucleotídeos único LRP1 (SNPS) juntamente com o polimorfismo encontrado no promotor, com base em suas freqüências, referências bibliográficas e funcionalidade (Tabela 2 e Figura 1). Os polimorfismos foram genotipados usando um Taqman Ensaio de reação de cadeia de polimerase baseado em polimerase e discriminação alélica com um aparelho de Biossistema Aplicado 7900.

Tabela 2. Características dos polimorfismos analisados

polimorfismo analisado variantes genômicas id dbsnp alelos 1 > 2 a Genomic Localization Efeito funcional MAF B MAF neste estudo
1 c.1-25c g rs35282763 c > g promotor Nova sequência SP1 0.08 0,08
2 ivs2 + 617c > t rs715948 c > t intron 2 0,32 0,31
3 c.677c > t rs1799986 c > t exon 3 asp100asp 0,14-0.15 0,14
4 c.1116c > t rs1800127 c > t exon 6 ala217val 0,03 0,03
5 ivs6 + 245c > g rs7968719 g > c intron 6 0,49 0,47
6 ivs19 + 144c > t rs1800176 c > t Intron 19 0,30 0,30
7 c.4012c > t rs1800194 c > t exon 22 cys1182cys 0,31 0,30 8 ivs38 + 53c > t rs1800181 c > t Intron 38 0,30 0,30 9 c.10249g > rs1140648 g > exon 61 thr3261th 0,28 0,30 10 ivs83 + 139A > g rs1800164 g > Intron 83 0,28 0,35

dbsnp: Banco de dados de polimorfismo único nucleotídeo; MAF: Frequência de alelos menores; SNP ID: identificação de polimorfismo nucleotídico único.

A alelo 1 ocorre com mais frequência.
B Freqüência de alelo menor no painel Hapmap CEU ou CEP, encontrado na literatura. 8,15,16

Figura 1. Análise de desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos de nucleotídeos únicos LRP1 analisados. Blocos HAPLotype definidos usando o método de Gabriel (HAPLOVIEW 4.0), com o desequilíbrio do vínculo entre pares de marcadores mostrados como R2 (em preto R2 > 0,8). O quadro à direita do diagrama mostra um bloco com forte ligação formada por polimorfismos de nucleotídeos único 6 a 9 do estudo.

Análise Funcional do C.677C > t Polimorfismo (RS1799986)

O possível efeito funcional do polimorfismo no processamento de mRNA foi analisado utilizando suporte bioinformático e análise minigene in vitro. Neste teste, o exon de interesse é clonado entre dois exons sintéticos para análise subseqüente de processamento de RNA (“métodos” no material suplementar).

Análise Estatística

Os dados clínicos foram comparados entre os grupos utilizando o teste T Student Para variáveis contínuas, χ2 para variáveis categóricas e testes não paramétricos para variáveis não normalmente distribuídas (SPSS V.14.0). Freqüências alelos foram calculadas a partir dos genótipos dos assuntos.Para cada polimorfismo, usamos o χ2 para testar se a distribuição atendeu ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, e usamos a regressão logística multivariada para analisar a associação entre polimorfismos de genes LRP1 e PCVD em HFH, bem como analisar a interação com covariates.17, Calculou a razão de probabilidades (ou) e 95% de intervalos de confiança (IC95%) para cada genótipo em comparação com o homozigoto para o alelo mais frequente ou de referência, e estimamos significância usando um limite de p

O poder estatístico da amostra (77 casos e 262 controles) foi estimado em 80% para uma prevalência da doença de 20% e um efeito do polimorfismo em risco de um evento cardiovascular > 2 e > 1.7 para frequências alélicas de 0,14 e 0,30, respectivamente (quanto v 1.2). Incluímos marcadores com freqüências alelos menores devido à sua funcionalidade (polimorfismo promotor, SNP1 e a mutação de mudança de aminoácidos SNP4).

Todas as análises foram ajustadas para idade, sexo e outros fatores de risco CVD no estudo população (Tabela 1). Frequências HAPlotype foram estimadas por blocos de desequilíbrio de ligação (LD) definidos pelo método Gabriel, e os valores de LD e R2 entre pares SNP foram calculados usando HaPloview v. 4.2 (Figura 1).

Características dos resultados da população do estudo por Presença ou ausência de doença cardiovascular prematura

As características da população do estudo de acordo com a presença ou ausência de PCVD são mostradas na Tabela 1. No momento da inscrição no estudo, 86,5% dos pacientes com HFH estavam recebendo redução de terapia. A doença arterial coronariana ou a doença cardíaca isquêmica representaram 93,4% dos eventos. Houve maior predisposição para o PCVD em homens (p = 0,004), em pacientes mais velhos (pp = 0,01). Não houve diferenças significativas na proporção de fumantes em cada grupo no momento da inclusão no estudo.

Algumas diferenças de sexo foram observadas (dados não mostrados na Tabela 1): O IMC foi 28.4 (6,6 ) Em mulheres com PCVD vs 26,7 (5,7) em mulheres sem PCVD (p = 0,137) e 27,7 (3.7) em homens com PCVD em comparação com 25,9 (3.1) em homens sem PCVD (p = 0,003). Não houve diferenças significativas na frequência da hipertensão e do tabagismo entre os dois grupos, embora a hipertensão fosse mais prevalente em mulheres (40% em PCVD vs 18,2% em não-PCVD, p = 0,014) do que os homens (16,3% vs 13,2%, P = 0,612) e fumar foi mais prevalente em homens (82,6% em PCVD vs 58,7% em não-PCVD, p = 0,005) do que mulheres (16,7% vs 33,7%, p = 0,085). Enquanto a porcentagem de indivíduos com PCVD foi maior entre os pacientes com HFH e alelo null ou mais severas mutações no LDLR, as diferenças não foram significativas nesta amostra.

Rastreio de polimorfismos no promotor LRP1

detectamos um polimorfismo no promotor (Fig. 1a no material suplementar). De acordo com a análise do silico, este polimorfismo (c.1-25c > g) cria um novo site de ligação para o fator de transcrição SP1 (Fig. 1B, material suplementar).

Associação de polimorfismos e haplótipos com doença cardiovascular prematura em hipercolesterolemia familiar heterozigota

a distribuição de genótipos em conformidade com o equilíbrio Hardy-Weinberg em todos os polimorfismos analisados (p > .2) . As freqüências alelos observadas na população não diferiram significativamente dos dados publicados anteriormente (Tabela 2). Além disso, os marcadores 2, 3, 5 e 6 são snps de acordo com o navegador genoma HAPMAP3, lançamento # 2.

Os resultados da associação com o PCVD após ajustar para idade, sexo, IMC e O efeito da mutação LDLR é mostrado na Tabela 3. Apenas SNP3 (RS1799986) mostrou uma associação significativa com o PCVD no modelo dominante (CT + TT vs CC, ou = 1,94; 95% CL, 1,08-3.48; p = 0,029) . Obtivemos resultados semelhantes após aumentar a amostra para 648 pacientes com HFH (133 com PCVD e 515 sem PCVD) (Tabela 3 em material suplementar) e reanalisando os dados (ou = 1,83; IC 95%, 1,16-2,88; p = 0,011 ).

Tabela 3. Associação de polimorfismos e doença cardiovascular prematura em hipercolesterolemia familiar heterozigota

95% IC, 95% intervalo de confiança; HFH, hipercolesterolemia familiar heterozigenta; ID, identificação; Ns, não significativo; Ou, odds ratio; PCVD, doença cardiovascular prematura; SNP, polimorfismo nucleotídeo único.
Todos os valores ajustados para idade, sexo, índice de massa corporal e tipo de mutação de receptor de lipoproteína de baixa densidade; RS1799986 mostrou um valor de P significativo (modelo dominante, genótipos CT + TT vs cc).

* Resultados após aumentar a amostra para 515 assuntos sem PCVD e 133 com PCVD.

A frequência alelo para o polimorfismo RS1799986 na população com HF foi semelhante à da população de controle espanhol (p = 0,76) e outras populações caucasianos (consulte “Métodos” e Tabela 4 em material suplementar).

Analisamos a interação do polimorfismo RS1799986 com o tipo de mutação LDLR (alelo nulo, atividade deficiente ou indeterminada), e encontrou uma maior porcentagem de mutações nulas de alelo em indivíduos com o polimorfismo e o PCVD em comparação com os pacientes sem PCVD. No entanto, os resultados não são conclusivos devido ao tamanho da amostra (Tabela 5 no material suplementar).

Usando o Haploview, examinamos a existência de blocos de polimorfismos com um forte desequilíbrio de ligação. Observamos apenas um bloco, formado por SNP 6 a 9 de acordo com o método de Gabriel (Figura), Mas nenhum haplótipo associado à doença (Tabela 4).

Tabela 4. Associação de haplótipos com doença cardiovascular prematura, após o ajuste para fatores de risco (n = 339)

snp ID SNP hfh (n = 339) frequências genotípicas por (95% ci)
1 rs35282763 cc cg gg .9
não pcvd 0,84 0.15 0.04
pcvd 0,88 0.11 0,01
2 RS715948 cc ct tt .86
não pcvd 0.5 0,38 0,13 pcvd 0.51 0,39 0,1
3 rs1799986 cc ct tt .029
não pcvd 0,77 0,2 0,02 1.94 (1.08-3.48)
pcvd 0.64 0,36 0 ct + tt vs cc
3 * rs1799986 cc ct tt .011
nenhum pcvd 0,76 0,22 0,02 1.83 (1.16-2.88)
pcvd 0,66 0.34 0 ct + tt vs cc
4 RS1800127 cc ct tt ns
não pcvd 0,95 0,05 0
pcvd 1 0 0
5 rs7968719 cc cg gg .79
sem pcvd 0,29 0,47 0,24
pcvd 0,33 0,39 0,28
6 rs1800176 cc ct tt .096
não pcvd 0,46 0,45 0,09
pcvd 0,48 0,49 0,03
7 rs1800194 cc ct tt .07
não pcvd 0,47 0,43 0.1
0,48 0,49 0,03
8 rs1800181 cc ct tt .07
não Pcvd 0,47 0,43 0.1
pcvd 0,48 0,49 0,03
9 rs1140648 cc ct tt .075
nenhum pcvd 0,46 0,45 0.1
pcvd 0,48 0,49 0,03
10 rs1800164 gg ag aa .72
não pcvd 0,42 0,45 0,13
pcvd 0,40 0,48 0,12

95% CI, intervalo de confiança de 95%; Ou, odds ratio. Frequência de haplótipos no bloco com forte ligação formada por polimorfismos de nucleótidos único 6 a 9, estimado usando o algoritmo máximo de expectativa; frequência total (doença cardiovascular prematura / doença cardiovascular prematura).

Como apontado na seção “Análise Estatística”, o tamanho inicial da amostra do estudo permitiu apenas detectar associações com um ou > 2, com 80% de energia para freqüências de alelo de 0,14, como aquela com SNP3. Devido à contínua matrícula de novos pacientes na coorte de estudo, foi possível expandir o tamanho da amostra de indivíduos com HFH para um total de 133 com PCVD e 515 PCVD (Tabela 3 no material suplementar). Isso nos permitiu detectar um estatisticamente significativo ou de 1,83 com potência estatística de 80% para esta frequência alelo (quanto v1.2.0).

Os resultados sugerem que a presença de O Tallele no polimorfismo C.677C > t (rs1799986) está associado a um risco aumentado de PCVD em HFH.

Análise Funcional do polimorfismo C.677C > t (rs179998)

Estudos funcionais descartou a possibilidade de que este polimorfismo possa alterar o padrão normal do processamento de mRNA (ver “Resul TS “e Fig. 2 no material suplementar).

Discussão

Estudos anteriores citaram a associação de polimorfismos LRP1 com doença arterial coronariana em populações caucasianas, 8, 19, 20 com doença arterial coronariana e longevidade, 21 e com trombose coronariana, 22, 23, embora outros estudos apresentaram resultados contraditórios ou menos significativos para tal associação em relação à dislipidemia ou doença de doença de doença15 e trombose.24 Esta e outra literatura sobre o envolvimento de polimorfismos LRP1 em doenças complexas estão incluídas no Resumo de Gläser et al.16 Recentemente, Peters et al., 25 em um estudo abrangente de genes candidatos envolvidos na eficácia das estatinas de redução de colesterol descobriram que um polimorfismo na Intron 2 de LRP1 (RS715948, SNP 2 deste estudo) foi associado a uma redução no infarto do miocárdio. No entanto, esta descoberta não foi replicada em nosso estudo de HFH usando um fenótipo CVD mais amplo do que o descrito acima.

Houve resultados conflitantes em relação ao envolvimento do C.677C > T polimorfismo com CVD em populações caucasianas. Pochathikorn et al., 20 em um estudo de 600 indivíduos com doença arterial coronariana e 700 controles, encontraram uma freqüência significativamente menor do genótipo TT do polimorfismo C.677C T em indivíduos com doença cardíaca coronária em comparação com os controles. Por outro lado, Benes et al., 21 em um estudo com 654 indivíduos com doença arterial coronariana e 525 controles, descobriram que o alelo T aumentou o risco de doença cardíaca coronariana em indivíduos com o genótipo do inibidor do ativador do plasminogênio 5G / 5G .

Embora neste estudo tentássemos analisar polimorfismos em todo o gene, seu tamanho de cerca de 85kb significava que exigiríamos que um maior número de SNPs cubra a variabilidade máxima na região, particularmente no 5 ‘extremo, Onde a análise da região CH12: 5508548..55893389 com HAPLOVIEW (HAPMAP3 Genome Browser Browser # 2) indicou uma menor densidade de polimorfismos com LD (resultados não mostrados).

Limitações

Entre as limitações do estudo, Além dos derivados do tamanho da amostra e da potência do ensaio, são aqueles decorrentes do número de polimorfismos analisados e a probabilidade de encontrar uma associação por acaso. Os resultados devem, portanto, ser confirmados através da replicação em outras populações antes de passar para procurar outros polimorfismos em LD com a variante genética associada ao aumento do risco de PCVD.

O estudo calculou eventos cardiovasculares que ocorreram antes da inclusão O estudo usando diretrizes baseadas em idade estabelecidas para PCVD; No entanto, uma vez que esta foi uma coorte retrospectiva, pode ter havido algum viés de seleção, pois alguns casos fatais podem não ter sido incluídos. Uma importante limitação do projeto de estudo é que o fenótipo analisado foi baseado no ponto final, ou seja, o evento cardiovascular, portanto, nenhum dado disponível sobre o grau de doença aterosclerótica antes do evento, como o número de embarcações afetadas; Isso exigiria outro tipo de design e análise clínica que não fossem considerados em todas as amostras presentes.

Como descrito na literatura, 26 O efeito aditivo de várias variantes genéticas pode ajudar a definir melhor o risco de doença cardíaca isquêmica e, por extensão, CVD. Por conseguinte, seria interessante analisar as variantes funcionais da LRP1 juntamente com outros genes associados à doença e / ou envolvidos em processos semelhantes.

Conclusões

Parece que o alelo T do C.677C > T (RS179998) O polimorfismo aumenta o risco de PCVD em HFH. Como a funcionalidade do polimorfismo não foi demonstrada, esta presumivelmente será encontrada em LD com outra variante genética que aumenta o risco de CVD.Outros estudos são necessários para replicar os resultados do presente estudo em outras populações e, em seguida, para determinar o (s) polimorfismo (s) com um forte (s) com RS179998 e uma associação com doença cardiovascular.

Financiamento

Este estudo foi suportado em Parte por financiamento de SAF2010-16549, CNIBN-08-2008 e Ciberobn CB06 / 03.

conflitos de interesse

Nenhum declarado.

Agradecimentos

Nós Gostaria de reconhecer Nuria Sala, Xavier Muñoz (ICO-Idibell) e Mónica Gratacós (CRG) por sua contribuição para a discussão científica do jornal, Montse Gómez por sua assistência técnica e a base para a hipercolesterolemia familiar para o seu apoio ao estudo.

material suplementar

Material suplementar associado a este artigo pode ser encontrado, na versão on-line, em http://dx.doi.org/10.1016/j.rec.2012.03.012.

Apêndice A. Dados suplementares

Recebido em 6 de outubro de 2011 Aceitou 7 de março de 2012

ou (95% ci) para o mais frequente p
ccca 0,692 (0,727-0.682) 1
tttg 0,298 (0,306-0,293) 0,84 (0,54-1,31) .44
Associação Geral para Haplotipos .15

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