Polimorfismele genetice LRP1 sunt asociate cu un risc prematură de boală cardiovasculară la pacienții cu hipercolesterolemie familială Revista Española de Cardiología

Introducere

Hipercolesterolemie familială (FH) este caracterizată de niveluri ridicate de colesterol de lipoproteine cu densitate redusă în plasmă. Aceasta duce la depozite ridicate de colesterol în țesuturi, ateroscleroză accelerată și un risc crescut de boală cardiovasculară prematură (PCVD) .1 Cele mai frecvente anomalii genetice constă din mutații în gena receptorului de lipoproteină cu densitate redusă (LDLR); Frecvența populației hipercolesterolemie familială heterozygoasă (HFH) este de aproximativ 1/500. Deși genetic boala este cauzată de mutații în gena LDLR, fenotipul clinic al FH poate varia indiferent de mutație și se presupune că această variabilitate se datorează atât factorilor de mediu cât și genetici.2, 3

descoperire Variațiile altor gene care pot modifica susceptibilitatea la evenimentele cardiovasculare sunt de mare interes din cauza utilizării lor posibile ca predictori ai bolii.4 Genele implicate în absorbția colesterolului și homeostazia sunt candidați buni pentru acest tip de studiu. Proteina 1 legată de receptor de lipoproteină cu densitate redusă (LRP1) este un receptor de transmembrana multiligand aparținând familiei LDLR, care leagă lipoproteinele cu densitate mică și facilitează îndepărtarea unei mari varietăți de liganzi implicați în fibrinoliză, aterogeneza și trombogeneza.5 , 6, 7 supraexprimarea LRP1 în placa aterosclerotică a fost demonstrată în modele animale și oameni.8, 9 mai multe studii au arătat o relație între modificări în expresia LRP1 și boala coronariană.8, 10 supraexpresie a fost, de asemenea, descrisă în proteină și ARNA cu pacienții cu homozigous FH.11 În ansamblu, rezultatele publicate indică faptul că LRP1 poate fi un receptor cheie în patogeneza aterosclerozei.

Scopul acestui studiu a fost de a analiza dacă există polimorfisme genetice LRP1 care sunt asociate Odată cu apariția PCVD în FH s „în materialul suplimentar). Pacienții au primit un diagnostic de boală cardiovasculară (CVD) dacă a existat o istorie de infarct miocardic, bypass sau angioplastie coronariană, angină pectorală cu ateroscleroză coronariană diagnosticată angiografic (stenoză > 50%), accident vascular cerebral sau un eveniment vascular periferic. Boala cardiovasculară a fost considerată PCVD dacă evenimentul a avut loc înainte de vârsta de 55 de ani la bărbați și înainte de vârsta de 65 de ani la femei.14 Pentru fiecare pacient, datele au fost colectate pe niveluri de lipide din sânge, hipertensiune arterială, diabet zaharat și fumatul; Au fost înregistrate și datele antropometrice. Caracteristicile populației de studiu sunt prezentate în Tabelul 1; Mutațiile LDLR au fost identificate la toți pacienții. Detaliile mutațiilor găsite și clasificarea acestora bazată pe activitatea LDLR reziduală (null, deficitar sau nedeterminat) pot fi găsite în „Metode” și tabelul 1 din materialul suplimentar.

Tabelul 1. Caracteristicile pacienților de studiu Cu hipercolesterolemie familială heterozygoasă, grupată de boală cardiovasculară prematură

28.01 ± 5.0

.925

Tr>

APOB, MG / DL

Activitate scăzută

not pcd (n = 262) PCVD (n = 77)
111 (42.4) 47 (35.9) .004
151 (57.6) 30 (41.1)
Vârsta, Ani 45.2 ± 15.3 53.19 ± 11.3
BMI 26.3 ± 4.8 .014
Hipertensiune 42 (16.1) 20 (26) .06
Fumătorii 115 (43,8) 42 (54.5) .067
Diabetes 11 (4) 3 (4) .98
Colesterol total, MG / DL 287,1 ± 62,1
LDL Colesterol, Mg / DL 215,3 ± 58,7
HDL Colesterol, mg / dl 52,2 ± 13
Trigliceride, MG / DL 92,5 (38-320) 94,5 (44-258) .589
apoa, mg / dl 141.1 ± 35,2 138.8 ± 32.1 166,4 ± 43,9
Efectul lui Mutația activității LDLR .527
null alle 161 (61,6)
75 (28,5) 22 (28.6)
Activitate nedeterminată 26 (9.9) 4 (5.2)

apoa, apolipoproteina a; Apob, apolipoproteină b; IMC, indicele de masă corporală; HDL, lipoproteină de înaltă densitate; LDL, lipoproteină de joasă densitate; LDLR, receptor de lipoproteine cu densitate redusă; PCVD, boala cardiovasculară prematură. Rezultatele sunt prezentate ca medie ± deviație standard, nr. (%) sau mediani (intervalul).
Semnificația statistică a fost setată la p

Genotiping

Am căutat mai întâi polimorfisme în promotorul LRP1 prin polimorfisme de conformitate cu un singur strand și secvențiere într-o probă de 86 de pacienți cu HFH. Am analizat apoi asociația genetică de 10 polimorfisme cu PCVD; ADN-ul a fost extras din sângele periferic folosind kitul de purificare a ADN-ului Wizard® (Promega).

Screening-ul polimorfismelor în promotorul LRP1

vezi „Metode” și Tabelul 2 din materialul suplimentar.

Asociația genotipică Studiu

Am selectat 10 polimorfisme nucleotidice unice LRP1 (SNP) împreună cu polimorfismul găsit în promotor, pe baza frecvenței, referințelor bibliografice și a funcționalității (Tabelul 2 și Figura 1). Polimorfismele au fost genotipate folosind un taqman ® Testul de reacție a lanțului polimerazei și discriminarea allică cu un aparat aplicat biosistem 7900.

Tabelul 2. Caracteristicile polimorfismelor analizate

Promotor

0.30

RS1800181

0//td>

Polimorfism analizat Variante Genomice SNP ID DBSNP Alleles 1 > 2 A Localizarea genomică Efectul funcțional MAF B MAF în acest studiu
1 c.1-25c g RS35282763 c > G New SP1 secvență 0.08 0.08
2 IVS2 + 617C > t rs715948 c > t intron 2 0.32 0.31
3 c.677c > T RS1799986 C > t exon 3 ASP100ASP 0.14-0.15 4 C.1116C > t rs1800127 c > t exon 6 ALA217VAL 0.03 5 IVS6 + 245C > g rs7968719 g > c intron 6 0.47 6 IVS19 + 144C > t rs1800176 c > t intron 19 0.30
7 C.4012C > T RS1800194 C > T EXON 22 TD> 0.31
8 IVS38 + 53C > T C > t intron 38 0.30 0.30
9 C.10249G > RS1140648 G > A EXON 61 THR3261THR 0.30
10 IVS83 + 139A > g rss1800164 g> A Intron 83 0.28

DBSNP: bază de bază de polimorfism nucleotide; MAF: frecvența minoră a alelei; ID-ul SNP: identificarea polimorfismului nucleotidic unic.

O alele 1 apare cel mai frecvent.
B Frecvența de alelă minoră în panoul Ceu Hapmap sau Cheph, găsit în literatură. 8,15,16

Figura 1. Analiza dezechilibrului de legare între polimorfismele de nucleotidice LRP1 analizate. Blocurile Haplotip definite utilizând metoda lui Gabriel (HaploView 4.0), cu dezechilibrul de legături între perechi de markeri arătați ca R2 (în negru R2 > 0.8). Cadrul din partea dreaptă a diagramei prezintă un bloc cu o legătură puternică formată de polimorfisme de nucleotide unice 6 până la 9 din studiu.

Analiza funcțională a C.677C > t Polimorfismul (RS1799986)

Efectul funcțional posibil al polimorfismului asupra prelucrării ARNm a fost analizat utilizând suportul bioinformatic și analiza minigenei in vitro. În acest test, exonul de interes este clonat între doi exoni sintetici pentru analiza ulterioară a prelucrării ARN („Metode” în materialul suplimentar).

Analiza statistică

Au fost comparate date clinice între grupuri care utilizează testul studentului t Pentru variabilele continue, χ2 pentru variabilele categorice și teste nonparametrice pentru variabilele distribuite în mod normal (SPSS V.14.0). Frecvențele allelor au fost calculate din genotipurile subiecților.Pentru fiecare polimorfism, am folosit χ2 pentru a testa dacă distribuția sa întâlnit cu echilibrul Hardy-Weinberg și am folosit regresia logistică multivariată pentru a analiza asocierea dintre polimorfismele genetice LRP1 și PCVD în HFH, precum și pentru a analiza interacțiunea cu covariații.17, 18 noi calculat raportul de șanse (sau) și intervale de încredere de 95% (95% CI) pentru fiecare genotip comparativ cu homozigot pentru cele mai frecvente sau de referință alele și am estimat semnificația utilizând un prag de p

anterior Puterea statistică a eșantionului (77 de cazuri și 262 de controale) a fost estimată la 80% pentru o prevalență a bolii de 20% și un efect al polimorfismului asupra riscului unui eveniment cardiovascular > 2 și > 1.7 pentru frecvențele allică de 0,14 și, respectiv, 0,30 (Quanto V 1.2). Am inclus markeri cu frecvențe de alele inferioare din cauza funcționalității lor (polimorfism promotor, SNP1 și mutația de schimbare a aminoacizilor SNP4).

Toate analizele au fost ajustate pentru vârsta, sexul și alți factori de risc CVD din studiu populația (tabelul 1). Frecvențele haplotipului au fost estimate prin blocuri de dezechilibru (LD) definite de metoda Gabriel, iar valorile LD și R2 între perechi SNP au fost calculate utilizând HaploView v. 4.2 (Figura 1).

Caracteristicile rezultatelor populației de studiu de către Prezența sau absența bolii cardiovasculare premature

Caracteristicile populației de studiu în funcție de prezența sau absența PCVD sunt prezentate în tabelul 1. La momentul înscrierii în studiu, 86,5% dintre pacienții cu HFH au primit scăderea lipidelor terapie. Boala coronariană sau boala cardiacă ischemică au reprezentat 93,4% din evenimente. A existat o predispoziție mai mare la PCVD la bărbați (p = 0,004), la pacienții vârstnici (PP = 0,01). Nu au existat diferențe semnificative în proporția fumătorilor din fiecare grup la momentul includerii în studiu.

Au fost observate unele diferențe bazate pe sex (datele care nu sunt prezentate în tabelul 1): IMC a fost 28,4 (6.6 ) la femeile cu PCVD vs 26,7 (5.7) la femeile fără PCVD (p = .137) și 27,7 (3.7) la bărbații cu PCVD comparativ cu 25,9 (3.1) la bărbați fără PCVD (p = .003). Nu au existat diferențe semnificative în ceea ce privește frecvența hipertensiunii și fumatul dintre ambele grupuri, deși hipertensiunea arterială a fost mai răspândită la femei (40% în PCVD vs 18,2% în non-PCVVD, p = 0,014) decât bărbații (16,3% față de 13,2%, P = .612) și fumatul a fost mai răspândit la bărbați (82,6% în PCVD vs 58,7% în Non-PCVVD, p = 0,005) decât femeile (16,7% față de 33,7%, p = .085). În timp ce procentajul persoanelor cu PCVD a fost mai mare în rândul pacienților cu mutații HFH și Null-alele sau mai severe în LDLR, diferențele nu au fost semnificative în această probă.

Screening-ul polimorfismelor în promotorul LRP1

Am detectat a polimorfism în promotor (fig.1a în material suplimentar). Conform analizei Silico, acest polimorfism (C.1-25c > g) creează un nou situs de legare pentru factorul de transcripție SP1 (figura 1B, material suplimentar). /p> Asociația de polimorfisme și haplotipuri cu boală cardiovasculară prematură în hipercolesterolemia familială heterozygoasă

Distribuția genotipurilor conforme cu echilibrul Hardy-Weinberg în toate polimorfismele analizate (P > .2) . Frecvențele alele observate în populație nu diferă semnificativ de datele publicate anterior (tabelul 2). În plus, markerii 2, 3, 5 și 6 sunt SNP-uri de etichetare în funcție de browserul Hapmap3 Genome, eliberați # 2.

Rezultatele asociației cu PCVD după ajustarea pentru vârstă, sex, IMC și Efectul mutației LDLR este prezentat în Tabelul 3. Numai SNP3 (RS1799986) a arătat o asociere semnificativă cu PCVD în modelul dominant (CT + TT VS CC, sau = 1,94; 95% CI, 1.08-3.48; p = .029) . Am obținut rezultate similare după creșterea probei la 648 de pacienți HFH (133 cu PCVD și 515 fără PCVD) (tabelul 3 în material suplimentar) și reanalizând datele (sau = 1,83, 95% CI, 1.16-2.88; p = .011 )

SNP ID HFH (N = 339) Frecvențe genotipice POR (95% CI) 1 RS35282763 CC CG GG 0.84 0.15 0.04 PCVD 0.88 0.11

2

RS715948 ct tt .86 0.5 0.38 0.13 PCVD 0.51 0.39 0.1 RS1799986 CC CT tt .029 Nu PCVD 0.77 0.2 0.02 1.94 (1.08-3.48) PCVD 0.64 0.36 0 ct + tt vs cc 3 * RS1799986 cc tt .011 Nu PCVD 0.76 0.22 0,02 1.83 (1.16-2.88) PCVD 0.66 0.34 0 CT + TT vs CC 4 RS1800127 cc ns

ns 0.95 0.05 0 1 0

0

0 RS7968719 CC cg gg .79 Nu PCVD 0.29 0.47 0.24 PCVD 0.33 0.39 0.28 6 RS1800176 CC ct tt 0.46 0.45 .45 0.09 PCVD 0.48 0.49 0.03 7 RS1800194 CC

d

tt Nu PCVD 0.47 0.43 0.1 0.48 0.49 0,03 8 CC CT TT .07 Nu PCVD 0.47 0.43 0.1 PCVD 0.48 0.03 9 RS1140648 cc tt .075 0.46 0.45 0.1 PCVD 0.48 0.49 0.03

10

RS1800164 GG AA .72 TD Nu PCVD 0.42 0.45 0.13 PCVD 0.40 0.48 0.12

iv id = „28a774264”

95% CI, 95% interval de încredere; Hfh, hipercolesterolemie familială heterozygoasă; ID, identificare; Ns, nu semnificativ; Sau, rata de șanse; PCVD, boală cardiovasculară prematură; SNP, un singur polimorfism nucleotidic.
Toate valorile ajustate pentru vârstă, sex, indice de masă corporală și tip de mutație a receptorului de lipoproteine cu densitate redusă; RS1799986 a arătat o valoare P semnificativă (model dominant, genotipuri CT + TT vs CC).

* rezultate după creșterea probei la 515 subiecți fără PCVD și 133 cu PCVD.

Frecvența allei pentru polimorfismul RS1799986 în populația cu HF a fost similar cu cea a populației de control spaniolă (P = 76) și a altor populații caucaziene (vezi „Metodele” și tabelul 4 în materialul suplimentar).

Am analizat interacțiunea polimorfismului RS1799986 cu tipul de mutație LDLR (alele nulă, activitate deficitară sau nedeterminată) și am găsit un procent mai mare de mutații nulle alele la indivizi cu polimorfismul și PCVD comparativ cu pacienții fără PCVD. Cu toate acestea, rezultatele nu sunt concludente datorită dimensiunii eșantionului (tabelul 5 din material suplimentar).

Folosind HaploView, am examinat existența unor blocuri de polimorfisme cu un dezechilibru puternic de legare. Am observat doar unul bloc, format de SNP 6 la 9 conform metodei lui Gabriel (Figura), dar nici un haplotip asociat bolii (Tabelul 4).

Tabelul 4. Asocierea haplotipurilor cu boală cardiovasculară prematură, după ajustarea pentru factorii de risc (n = 339)

TR> Tr >

Frecvența haplotipurilor sau (95% CI) pentru cea mai frecventă p
CCCA 0.692 (0.727-0.682) 1
TTTG 0.298 (0.306-0.293) 0.84 (0.54-1.31) .44
Asociația Generală pentru Haplotipuri

95% CI, interval de încredere de 95%; Sau, rata de șanse.
Frecvența haplotipurilor în blocul cu o legătură puternică formată prin polimorfisme de nucleotide unice 6 până la 9, estimate utilizând algoritmul maxim de așteptare; Frecvența totală (boală cardiovasculară prematură / fără boală cardiovasculară prematură).

Așa cum a subliniat secțiunea „Analiză statistică”, dimensiunea eșantionului inițial a permisului de a detecta asociațiile cu un sau > 2, cu 80% putere pentru frecvențe alele de 0,14, cum ar fi cea cu SNP3. Datorită înscrierii continue a noilor pacienți în cohorta de studiu, a fost posibilă extinderea dimensiunii eșantionului persoanelor cu HFH la un total de 133 cu PCVD și 515 fără PCVD (tabelul 3 din material suplimentar). Acest lucru ne-a permis să detectăm un statistic semnificativ sau de 1,83 cu o putere statistică 80% pentru această frecvență de față (Quanto V1.2.0).

Rezultatele sugerează că prezența lui ALELE T în polimorfism C.677C > t (RS1799986) este asociat cu un risc crescut de PCVD în HFH.

Analiza funcțională a polimorfismului C.677C > t (RS179998)

Studiile funcționale au exclus posibilitatea ca acest polimorfism să modifice modelul normal al procesării MRNA (vezi „restul Ts „și fig.2 în materialul suplimentar).

Discuție

Studiile anterioare au citat asocierea polimorfismelor LRP1 cu boala coronariană în populațiile caucaziene, 8, 19, 20 cu boală coronariană și longevitate, 21 și cu tromboză coronariană, 22, 23 deși alte studii au prezentat rezultate contradictorii sau mai puțin semnificative pentru o astfel de asociere în ceea ce privește dislipidemia sau boala Alzheimer15 și tromboza.24 Aceasta și altă literatură cu privire la implicarea polimorfismelor LRP1 în boli complexe sunt incluse în boli complexe Rezumat de către Gläser et al.16 Recent, Peters și colab., 25 într-un studiu cuprinzător al genelor candidate implicate în eficacitatea statinelor de scădere a colesterolului, a constatat că a fost un polimorfism în Intron 2 din LRP1 (RS715948, SNP 2 al acestui studiu) asociate cu o reducere a infarctului miocardic. Cu toate acestea, această constatare nu a fost reprodusă în studiul HFH utilizând un fenotip mai larg de CVD decât cel descris mai sus.

Au fost rezultate conflictuale în ceea ce privește implicarea C.677C > t polimorfism cu CVD în populațiile caucaziene. Pocathikorn et al., 20 într-un studiu de 600 de persoane cu boală coronariană și 700 de controale, a găsit o frecvență semnificativ mai mică a genotipului TT al C.677C > t polimorfism la indivizi cu boli coronariene în comparație cu controalele. Pe de altă parte, Bene și colab., 21 într-un studiu cu 654 de persoane cu boală coronariană și 525 de controale, a constatat că allele T a crescut riscul de boală cardiacă coronariană la subiecții cu genotipul inhibitor de 6G / 5G Plasminogen Activator-1 .

Deși în acest studiu am încercat să analizăm polimorfisme pe tot teritoriul genei, mărimea sa de aproximativ 85kb înseamnă că vom avea nevoie de un număr mai mare de SNP-uri pentru a acoperi variabilitatea maximă în regiune, în special la extremitatea de 5 ‘ În cazul în care analiza regiunii CHR12: 5508548..55893389 cu HaploView (Hapmap3 Browser Browser Release # 2) a indicat o densitate mai mică de polimorfisme cu LD (rezultatele nereprezentate).

Limitări

Printre limitările studiului, În plus față de cele derivate din dimensiunea și puterea eșantionului, sunt cele derivate din numărul de polimorfisme analizate și probabilitatea de a găsi o asociere din întâmplare. Rezultatele ar trebui, prin urmare, să fie confirmate prin replicarea în alte populații înainte de a trece la căutarea altor polimorfisme în LD cu varianta genetică asociată cu riscul crescut de PCVD.

studiul a calculat evenimentele cardiovasculare care au avut loc înainte de includerea în studiul care utilizează orientări bazate pe vârstă stabilite pentru PCVD; Cu toate acestea, deoarece aceasta a fost o cohortă retrospectivă, s-ar putea să fi fost o anumită părtinire de selecție, deoarece pot fi incluse unele cazuri fatale. O limitare importantă a proiectării studiului este că fenotipul analizat sa bazat pe punctul final, adică evenimentul cardiovascular, astfel încât nu au fost disponibile date privind gradul de boală aterosclerotică înainte de eveniment, cum ar fi numărul de nave afectate; Acest lucru ar necesita un alt tip de analiză și analiză clinică care nu au fost luate în considerare în toate probele actuale.

Așa cum este descris în literatură, 26 Efectul aditiv al mai multor variante genetice poate ajuta la definirea mai bună a riscului de Boala cardiacă ischemică și, prin extensie, CVD. Ar fi, prin urmare, interesant să analizăm variantele funcționale ale LRP1 împreună cu alte gene asociate cu boala și / sau implicate în procese similare.

Concluzii

Se pare că allele T a C.677C > t (RS179998) Polimorfismul crește riscul de PCV în HFH. Deoarece funcționalitatea polimorfismului nu a fost demonstrată, acest lucru se va găsi probabil în LD cu o altă variantă genetică care mărește riscul de CVD.Sunt necesare studii suplimentare pentru a reproduce rezultatele studiului de față în alte populații și apoi pentru a determina polimorfismul (polimorfismul) având o LD puternic cu RS179998 și o asociere cu boală cardiovasculară.

Finanțarea

Acest studiu a fost susținut în acest studiu parte prin finanțarea de la SAF2010-16549, CNIC-08-2008 și Ciberobn CB06 / 03.

Conflicte de interese

none declarată.

Mulțumiri

am fi Ca să recunoască Nuria Sala, Xavier Muñoz (ICO-IDIBELLL) și Mónica Grattacós (CRG) pentru contribuția lor la dezbaterea științifică a lucrării, Montse Gómez pentru asistența tehnică și Fundația pentru hipercolesterolemie familială pentru sprijinul lor pentru studiu.

Material suplimentar

Material suplimentar asociat cu acest articol poate fi găsit, în versiunea online, la http://dx.doi.org/10.1016/j.rec.2012.03.012.

Anexă A. Date suplimentare

Primit 6 octombrie 2011
Acceptat 7 martie 2012

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile obligatorii sunt marcate cu *